mRNA 3’端测序,Quanteq pool样品barcode 3‘ mRNA-seq文库构建试剂盒

2022年7月7日 作者 jinpanbio

mRNA 3’端测序

Quanteq pool样品barcode 3‘ mRNA-seq文库构建试剂盒

mRNA 3'端测序

 

产品优势:

  • 对于筛查项目是高性价比的基因表达分析方法
  • 批量处理,省时、省力、省成本
  • 可从几个样本到36,864个样本的批量处理

简介
迄今为止,基因表达谱分析是RNA-Seq在生物医学研究和诊断中最常用的应用。传统的基因表达项目使用mRNA测序技术,可以对全长转录本进行单核苷水平的全面解析,但对样品处理数量有限,成本高。尽管测序的价格在持续下降,样品制备、测序和数据处理仍然是限制高通量筛选的主要成本因素。

3’ mRNA-Seq 是基因表达谱分析的强有力工具
3’mRNA-Seq方法生成的NGS文库插入片段为多聚腺苷酸RNAs的3端,无需事先进行poly(A)富集处理(表1)。
表1丨常规mRNA-Seq和QuantSeq 3′ mRNA -Seq基因表达谱分析方案比较。

mRNA 3'端测序

*文库制备的总体时间,不包括QC

由于3′ mRNA-seq每个转录本只产生一个文库片段,比对到给定基因的reads与其表达量成正比。3′ mRNA-Seq不依赖于正确的异构体(isoform)注释和鉴定来确定确切基因表达值。此外,3′ mRNA-Seq对RNA质量的差异不敏感。另一方面,传统的mRNA-seq需要高质量的RNA来富集mRNA,且对更长的转录本有偏好性,因为这些转录本产生更多的片段。因此,无论转录本长度如何,3′ mRNA-Seq为基因表达谱提供了一个可靠且经济的解决方案1
QuantSeq-Pool 加快基因表达项目研究
Lexogen QuantSeq-Pool结合了早期样本barcode标记和3′ mRNA-Seq的所有的优点(图1)。因此,QuantSeq-Pool极大地增加了混样的能力,并且高度精简的流程减少了手动操作时间、耗材和测序的费用。

mRNA 3'端测序

mRNA 3'端测序mRNA 3'端测序

Figure 1 | 早期的样本条barcode标记允许在一个反应中批量处理96个样本。可通过384 UDI index最多处理至36864个样本。

在文库制备的初始步骤中,通过barcode进行样本标记,以支持后续单个标记样本的pooling。此外,在此步骤还引入了单分子标签(UMIs),可消除PCR扩增带来的偏好性。通过将多达96个样品合并到一个反应中,4.5小时即可完成文库制备。批处理通过减少处理时间和消除定量、质量控制及单个样品文库的等摩尔pooling需要,显著缩短了完整的RNA到测序的工作流程(图2)。
通量灵活,适用于大规模的通量项目
在文库扩增步骤中,可通过在文库的i5和i7位置引入额外的UDI index,以获得更高的通量。

mRNA 3'端测序mRNA 3'端测序

图2 | QuantSeq-Pool可使96个样本在约5.5小时内完成RNA-测序工作流程。在QuantSeq-Pool流程的初始步骤中,通过barcode进行样本标记,以支持多大96个样本的pooling,并在单个反应中进行后续文库生成和扩增步骤的批量处理。随后PCR,包含96个样品的文库纯化,从而减少了消除定量、质量控制(QC)及单个样品文库的等摩尔pooling需要,显著减少上机测序前的准备工作。

QuantSeq-Pool通量灵活,96种i1 sample-barcodes与384 UDIindex组合,结合最大可用的一组384 udi,最可达36864个样本(表2)。因此,QuantSeq-Pool的三重-indexed文库(包含i1 sample-barcodes、UMI,12 nt UDIs及)非常适合大规模筛查项目和在NovaSeq上大规模混样测序。初始pooling工作流程的高效性使手工处理高通量项目成为可能,无需专门的自动化处理设备。如果需要,自动化友好地流程也可以适用于处理数以千计的样品。

表 2 | QuantSeq-Pool 可处理高达36864个样本

mRNA 3'端测序

稳定的基因检测性能,即使非常浅的测序深度
高通量筛选项目需要在较低的测序深度也可获得稳定且可靠的基因表达谱。QuantSeq-Pool可以可靠地检测到7500至9000个高表达基因,每个样本测序深度为100 K至1 M(图3)。
这种高灵敏度在8个重复中是一致的,这归功于早期pooling和批处理减少技术误差。
因此,在更低或相同成本下,可增加更多的重复样本以获得更加可信的异基因表达。

mRNA 3'端测序

图3 | QuantSeq-Pool能够在低测序深度下实现稳定且一致的基因检测结果。以10 ng UHRR,用QuantSeq-Pool构建文库并测序,对每个样本以100 K、0.5 M和1 M reads数进行基因检测分析。基因检测的阈值为> 10 Counts Per Million (CPM)。

QuantSeq-Pool与Quantseq结果高度一致
QuantSeq-Pool可获得与Quantseq一致的结果,两者有良好相关性,且重复性好(图4)。轻微的差异主要体现在mt转录本上,这主要是由于Quantseq pool和Quangtseq操作流程上的差异导致,如对于低input,10 ng的RNA input量,Quantseq需要使用低input的操作流程。

mRNA 3'端测序

图4 | QuantSeq-Pool与Quantseq结果高度一致,重复性好。

QuantSeq-Pool结合了样本barcode标记和早期pooling与3′ mRNASeq的优点,是一种节省时间、测序数据量和数据分析工作的基因表达谱分析方法。
这意味着与传统的mRNA-Seq项目相比,总成本降低了10倍。input量通常可以低至10 ng总RNA,内置的UMIs可以消除PCR带来的偏好性,从而实现高度可信、稳定的基因表达分析。便捷的操作流程可以手动进行高通量量处理样本,而且对于需要大规模混样测序的项目也可用自动化操作流程。

订购信息:

Product # Product Kit Size
139.96 QuantSeq-Pool Sample-Barcoded 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit for   Illumina, 96 Rxn 96
101.96 Lexogen UDI 12 nt Set A1 (UDI12A_0001-0096), 1 rxn/UDI 96
102.96 Lexogen UDI 12 nt Set A2 (UDI12A_0097-0192), 1 rxn/UDI 96
103.96 Lexogen UDI 12 nt Set A3 (UDI12A_0193-0288), 1 rxn/UDI 96
104.96 Lexogen UDI 12 nt Set A4 (UDI12A_0289-0384), 1 rxn/UDI 96
105.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Set B1   (UDI12B_0001-0096), 1 rxn/UDI 96