分类：NEB基因编辑

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® 突变检测试剂盒

特性

· 基于 T7 核酸内切酶的基因编辑检测

概述

EnGen 基因编辑突变检测试剂盒为检测基因编辑效率提供一整套的试剂。试剂盒操作的第一步，首先使用
Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液从待测细胞中扩增出目的基因组的靶标区域（即通过 CRISPR/Cas9、
TALENs或 ZFN等方法进行了基因编辑的区域)，经退火、延伸步骤后，形成异源双链 DNA。在扩增子池中经过多轮循环后，基因插入和缺失(Indels)等造成的突变得到富集。第二步，将退火后的 PCR 产物用 EnGen T7 核酸内切酶 I 进行切割。 EnGen T7 核酸内切酶 I 是一种结构特异性酶，可有效识别大于1个碱基的基因错配。当错配出现时，DNA 分子的两条链被切割从而形成较小的片段。分析片段图谱可以对基因编辑实验的效率进行评估。
EnGen 基因编辑突变检测试剂盒包含一组对照模板和引物预混液，可用作 PCR 反应及 T7 核酸内切酶 I 消化实验的对照。对照模板和引物预混液中含有 2 种对照质粒和 1 对对照引物。经 PCR 扩增、变性、退火后，部分会形成含有10个碱基的插入突变，此种异源双链 DNA 正是 T7 核酸内切酶 I 的底物，600 bp 的 DNA 会被切割成 200 bp 和 400 bp 的两个片段；而同源双链 DNA 则不被 T7 核酸内切酶 I 切割。通过琼脂糖凝胶电泳或片段分析设备可以非常方便的分辨出同源（野生型）和异源（突变）片段。
试剂盒的实验流程经过优化，通过 Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液扩增得到的 PCR 产物可以不经纯化而直接用 T7 核酸内切酶 I 进行消化。 异源双链DNA 分子只需 15 分钟就可以被完全切割，随后用蛋白酶 K 将反应终止。 此外， Q5 热启动超保真聚合酶 2× 预混液还可以用于优化靶点扩增的实验 。
图1： 实验流程

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

将引物设计在已完成基因编辑位点的两侧，PCR 产物变性、退火后会生成三种结构。其中一种结构能够被 T7 核酸内切酶 I 切割（多于1个碱基错配的双链 DNA），经电泳分离和片段分析后，估算出基因编辑效率。

Engen 突变检测试剂盒组分

– Q5 热启动超保真聚合酶 2X 预混液
– NEBuffer 2
– EnGen T7 核酸内切酶 I
– 对照模板和引物预混液
– 蛋白酶 K.，分子生物级
– Quick-Load® 紫色 2-Log DNA Ladder （0.1 – 10.0 kb）
– 紫色凝胶上样染料 6X，无 SDS

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

 关于该酶特性和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375。

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes

#E3322V10 rxns

相关产品

紫色凝胶上样染料 6X
2-Log DNA Ladder（0.1-10.0kb）
低分子量 ssRNA Ladder
RNA 上样染料（2X）

特性：

一个小时甚至更短时间内快速合成微克级的 sgRNA
NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

概述

EnGen™ sgRNA 合成试剂盒, S. pyogenes 能简单快速合成 sgRNA 。利用试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性 DNA 序列，单管反应 30 分钟就能获得大量 sgRNA 。
自然界中，S. pyogenes Cas9 的启动与 2 种 RNA 有关。及 crRNA 和 trRNA。crRNA 又称CRISPR RNA，包含大约 20 个核苷酸，位于PAM （Protospacer Adjacent Motif)  NGG 序列的上游，与目标 DNA 反义链同源互补。另一种是 tracrRNA  又称  transactivating crRNA， tracrRNA 序列的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构可被 Cas9 识别。在实际操作中，将 tracrRNA  和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链指导 RNA ( sgRNA)  , 并与 Cas 9 形成复合体，识别并切割目标 DNA。
在 EnGen 2X sgRNA 反应混合液中，含有能被 S. pyogenes Cas 9 识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。退火形成互补链后由 DNA  聚合酶进行填充。最终生成用于转录的 dsDNA 模板。本试剂盒可在一个反应中完成 dsDNA 的合成及 RNA 转录，生成具有功能的 sgRNA。

实验流程：

 NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

A．特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子、~20 nt 目标特异性序列及与 S. pyogenes Cas9 识别支架序列互补的 14 nt 重叠区域（反应混合液中提供）。室温下，混合特异性目标链（或 EnGen sgRNA 调控序列）与 EnGen2X sgRNA 反应预混液（NTPs，dNTPs，S. pyogenes Cas9 识别支架序列）及 EnGen sgRNA 酶预混液（DNA 和 RNA 聚合酶）。B．在 37℃ 条件下，具有 14 nt 互补重叠区域的 2 个片段发生退火。C. DNA 聚合酶从 3´ 端开始延伸，形成一个双链 DNA 模板。D. RNA 聚合酶识别 T7 启动子及其下游的 dsDNA 并开始转录。最终形成的 sgRNA 包含目标特异片段、crRNA 和 tracrRNA。37℃ 条件下，单管反应 30 分钟即可完成所有步骤。

EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes 组分

– EnGen sgRNA 酶混合液
– EnGen 2X sgRNA 反应混合液，S. pyogenes
– DNase I （RNase-free）
– EnGen sgRNA control Oligo，S. pyogenes

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

关于该酶特性和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375。

Spy Cas9 核酸酶,基因编辑,应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

Spy Cas9 核酸酶

#M0386M（高浓度20X）2000 pmol

#M0386S70 pmol#M0386T（高浓度20X）400 pmol

特性

·双链 DNA 位点特异性切割
·基因组编辑 

概述

Cas9 核酸酶，S. pyogenes，是一种 RNA 介导的核酸内切酶，可以催化双链 DNA 的特异位点切割。其识别 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列的  NGG 处，在靶序列的 3 个碱基内进行切割。PAM 序列的 NGG 必须连在基因编辑靶标位点之后，位于与 sgRNA 互补的 DNA 的对链上。 

来源

重组 E. coli 菌株，其克隆有来自 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 基因。 

反应条件

1X Cas9 核酸酶反应缓冲液，37℃ 温育。

质保声明

Cas9 核酸酶，S. pyogenes 经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。

浓度

1 μM，20 μM

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

关于该酶性质和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375。 

Cas9 核酸酶，S.pyogenes 序列识别和 DNA 剪切工作原理示意图

 NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® Spy Cas9 NLS 核酸酶

#M0646M 2,000 pmol

#M0646T 400 pmol

特性

· 双链 DNA 位点特异性切割
·    基因组编辑

概述：

EnGen Cas9 核酸酶 NLS, S. pyogenes, 是一种 RNA 介导的核酸内切酶，可以催化双链 DNA 的特异位点切割。其识别 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列的 NGG 处，在靶序列的 3 个碱基内进行切割。PAM 序列的 NGG 必须连在基因编辑靶标位点之后，位于与 sgRNA 互补的 DNA 的对链上。在 EnGen Cas9 核酸酶 NLS, S. pyogenes 蛋白质的 N-端和 C-端都含有猴病毒40 (SV40) T 抗原的核定位序列 (NLS)。

来源：

 重组 E. coli 菌株，含有克隆自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的 Cas9 基因，在其编码蛋白的 N-端和 C-端都含有猿猴病毒 40（SV40）抗原的核定位序列（NLS），N-端同时带有 6X His标签。

反应条件：

1× Cas9 核酸酶反应缓冲液
37℃ 孵育

质保声明：

EnGen Cas9 核酸酶 NLS，S. pyogenes 经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。

浓度：

20 μM

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

 关于该酶特性和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375。

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® Spy Cas9 切刻酶

#M0650S70 pmol

#M0650T400 pmol

特性

Ÿ   体外切刻 dsDNA。

Ÿ   通过直接导入有活性的切刻酶复合物进行基因编辑。

概述

 EnGen ® Spy Cas9 切刻酶是 Cas9 核酸酶的突变体，其在 RuvC 核酸酶结构域中引入了点突变（D10A）。EnGen ® Spy Cas9 切刻酶可以产生切刻，但不能切割 DNA。利用 EnGen Cas9 切刻酶近距离地靶向两个目标位点，产生 DNA 双链断裂，并且降低脱靶效应。与 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes （NEB #E3322）兼容。

反应条件

 1X NEBuffer™ 3.1，37℃ 温育

热失活

 65°C，5 min

浓度

 1 µM，20 µM

质保声明

 EnGen ® Spy Cas9 切刻酶经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

 关于该酶性质和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® Spy dCas9（SNAP-tag®）核酸酶              #M0652S 70 pmol

#M0652T400 pmol

特性

·体外切刻 dsDNA。

·通过直接导入有活性的切刻酶复合物进行基因编辑。

概述

 EnGen ® Spy dCas9（SNAP-tag） 核酸酶是 Cas9 核酸酶的无活性突变体，保留了与 DNA 的结合活性。N 端 SNAP-tag 标签可与荧光基团、生物素和许多其它利于可视化和靶标富集的偶联物共价结合。与 EnGen sgRNA 合成试剂盒，S. pyogenes （NEB #E3322）兼容。

反应条件

 1X NEBuffer™ 3.1，37℃ 温育

浓度

 1 µM，20 µM

质保声明

 EnGen ® Spy dCas9（SNAP-tag） 核酸酶经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。详情请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

 关于该酶性质和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶

#M0653S
70 pmoles
#M0653T
2,000 pmoles

特性

·   体外切割 dsDNA。

·   通过直接导入有活性的核酸酶复合物进行基因编辑。

概述

 EnGen ® Lba Cas12a（Cpf1） 核酸酶识别富含 T 的 TTTN PAM 序列，为基因打靶开辟了额外的基因组区域。所需 gRNA短，仅40-44 个碱基。其有两个核定位信号，提高运输到细胞核的效率。其切割产物为5′ 突出端。该酶的活性温度区间为 16℃-48℃。与氨基酸球菌（Acidaminococcus）的同源酶相比，在更低温度下活性依然良好，能用于编辑冷血动物基因组，如斑马鱼和非洲爪蟾等。高浓度酶可用于显微注射、电转和脂质体转染.

反应条件

 1X NEBuffer™ 2.1，37℃ 温育

热失活

 65°C，10 min

浓度

 1 µM，100 µM

质保声明

 EnGen ® Lba Cas12a（Cpf1）经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

 关于该酶性质和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

Lba Cas12a（Cpf1） 核酸酶序列识别和 DNA 剪切工作原理示意图

 NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

产品资料 – 基因编辑 – 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

EnGen® Sau Cas9 核酸酶

#M0654S70 pmol

#M0654T400 pmol

特性

·体外切割 dsDNA
·通过直接导入有活性的核酸酶复合物进行基因编辑

概述

EnGen ® Sau Cas9 核酸酶识别 5′-NNGRRT-3′ PAM 序列，切割位于 PAM 序列上游的第 3 个碱基位置，切割后为平末端。其双端核定位序列（NLS）可提高运输到细胞核的效率。高浓度酶可用于显微注射、电转和脂质体转染。

反应条件

 1X NEBuffer™ 3.1，37℃ 温育

热失活

 65°C，5 min

浓度

 1 µM，20 µM

质保声明

 EnGen ® Sau Cas9 核酸酶经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。详情请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。

上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375

 关于该酶性质和产品应用的上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375。

Sau Cas9 核酸酶序列识别和 DNA 剪切工作原理示意图

 NEB代理 , 基因编辑 , 应用于CRISPR工作流程中的NEB特色产品

NEB代理 , 基因编辑 , 基因编辑相关核酸酶

产品资料 – 基因编辑 – 基因编辑相关核酸酶

Tth Argonaute 蛋白 (TtAgo)

#M0665S 50 pmol

特性

·TtAgo 来自嗜热栖热菌，是一种可编辑的核酸内切酶，在 5’ 磷酸化的单链 DNA（ssDNA） 指导下能够切割底物靶序列，在底物与向导 DNA 互补序列的磷酸二酯键处产生断裂。

·所需 5’ 磷酸化 ssDNA 长度短，仅 16 -18 nt，成本低，可用 NEB T4 PNK 进行磷酸化

·向导/靶标序列的选择不受相邻序列限制

·对 ssDNA 和大多数双链 DNA（dsDNA）底物活性较高（在 dsDNA 底物上产生切刻），对 ssRNA 底物也有一定活性

·适用于体外应用

·参考 Tth Argonaute (TtAgo) 实验的优化指南

概述

 TtAgo 是一种来自革兰氏阴性嗜热栖热菌（Thermus thermophiles）的原核 argonaute 蛋白，在 5′-磷酸化单链 DNA（16 – 18 nt）指导下，可发挥 DNA 介导的核酸内切酶作用。在二价 Mg2+（或Mn2+）金属离子存在时，该酶具有类 RNase H 活性（见产品使用说明 #1），并在与 DNA 向导链第 10 和 11 个碱基互补的碱基处切割底物。

TtAgo 工作示意图
NEB代理 , 基因编辑 , 基因编辑相关核酸酶
TtAgo 在 65-85℃ 时具有活性（见产品使用说明 #2），对 ssDNA 活性最高，其次是 dsDNA，对单链 RNA（ssRNA）底物活性最低。该酶与单链向导 DNA 协同作用时，不会切割 dsDNA ，而只是切刻与向导 DNA 链互补的底物 DNA 链。该酶对双链 RNA（dsRNA）底物无活性。切割后的 5’ 和 3’ 末端产物可进行下游连接（1）。结果表明，在某些情况下，反应中加入热稳定单链 DNA 结合蛋白（ET-SSB，NEB #M2401）和/或热稳定解旋酶有助于切割 dsDNA 底物。
无向导 DNA 的 TtAgo 会通过 “剪切” 来降解 dsDNA，这被认为是 TtAgo 从入侵的或外源 DNA 中自发产生向导 DNA 的机制。（2）为防止这种非特异性活性的产生，向导 DNA 的摩尔量应超过 TtAgo 量的 5 倍。此外，向导链要与 TtAgo 一起在 ～75℃ 条件下孵育 10-30 分钟，形成核蛋白复合物后再加入底物进行反应。更多详细信息，请参阅操作步骤、说明书和使用说明。
TtAgo 适用于体外应用。
随酶提供的试剂
ThermoPol 反应缓冲液套装
浓度
1 µM
来源
TtAgo 纯化自携带革兰阴性嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）克隆基因的大肠杆菌菌株，该克隆基因是 N 端含 6X His 标记的融合基因。
保存温度
-20°C
质保声明 
TtAgo 蛋白经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。详情请登陆 www.neb.com 或 www.neb-china.com。
上海金畔生物科技有限公司官网，NEB代理，订购热线：18301939375
1. Hunt, E. A., Evans Jr, T. C., & Tanner, N. A. (2018). Single-stranded binding proteins and helicase enhance the activity of prokaryotic argonautes in vitro. PloS One. 13 (8), e0203073.
2. Swarts, D., Szczepaniak, M., Sheng, G., Chandradoss, S., Zhu, Y., & Timmers, E. et al. (2017). Autonomous Generation and Loading of DNA Guides by Bacterial Argonaute. Molecular Cell.. 65 (6), 985-99.