KK2801/KK2802/KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增

　　甲基化研究时，亚硫酸盐处理将未被甲基化的C转变成U，导致基因片段中存在U。高保真酶因为有修复错配的功能，所以扩增过程中遇到U时会将其认作错误碱基进行切断，导致反应无法继续进行。KAPA HiFi Uracil+是在KAPA HiFi的基础上进行了改造，使其在PCR反应过程中遇到U不会终止反应，保证反应的正常进行。

　　1、主要应用

　　(1)二代测序中甲基化文库扩增; (2)其他甲基化研究。

　　2、技术优势

　　(1)可扩增含U的基因片段;(2)快速、高效; (3)产物Bias少;

　　(4)可扩增高AT/GC模板; (5)文库覆盖度高。

　　3、产品特点

　　(1)dUTP的存在对扩增无影响

　　上图：实时荧光PCR扩增含Uracil体系，显示dUTP对KAPA Uracil+无抑制作用。用SYBR Green荧光定量PCR监测452bp基因的扩增情况，模板10倍梯度稀释(80pM-0.8fM)，一组含有0.2mM的dUTP，另一组不含dUTP。扩增用的试剂分别为KAPA HiFi、KAPA HiFi Uracil+。结果显示KAPA HiFi在dUTP存在的情况下显著被抑制，而KAPA HiFi Uracil+则不受影响制。

　　(2)高效扩增经过亚硫酸盐处理的人类全基因组文库

　　亚硫酸盐处理容易造成DNA损伤和降低DNA产物量。所以扩增时，因为抑制剂的存在、高A/T含量、DNA受损伤等因素叠加，导致了PCR产物量偏低、片段尺寸不合适、GC Bias等负面情况的发生。为了对比KAPA HiFi Uracil+与安捷伦的Pfu Turbo Cx，我们对比扩增亚硫酸盐处理之后的人类基因组文库，验证文库扩增产量和扩增Bias。

　　用KAPA文库制备试剂盒制备片段长度为200-400bp的人类基因组文库，模板为5μg人类基因组DNA。亚硫酸盐处理之后，用KAPA文库定量试剂盒进行定量，发现约2.7%未转化基因组DNA残留。分别用KAPA HiFi Uracil+和安捷伦Pfu Turbo Cx扩增未稀释的亚硫酸盐处理后基因组DNA，然后再Bioanalyzer2100上进行分析扩增产物，结果如下图所示。

　　上面3幅图所示：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增的文苦苦产量更高(图B)，扩增批次间Bias更少(图C)。扩增循环数分别为12、14或16个，产物的分析采用Bioanalyzer2100(图A)。

　　(3)扩增高A/T真菌全基因组文库

　　上图：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增产物量较高，片段尺寸相对较大。(Bioanalyzer2100分析)。

　　如上两图所示：与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi Uracil+扩增甲基化文库优势明显，主要体现在覆盖深度以及扩增高AT/GC模板上。以上两图的结果为寄生虫基因组DNA经亚硫酸盐处理后，分别用安捷伦Pfu Turbo Cx和KAPA HiFi Uracil+扩增后经lllumina GAllx测序后的结果。

　　(4)人类甲基化测序：USC Epigenome中心用KAPA HiFi Uracil+评价人类基因组甲基化文库测序。KAPA HiFi Uracil+提高了人类基因组DNA甲基化测序的质量，尤其AT/GC含量较高的情况。

　　4、产品信息