NEB代理 , 蛋白表达和纯化技术 , 表达系统 :大肠杆菌

2022年11月8日 作者 jinpanbio
产品资料 – 蛋白表达和纯化技术 – 表达系统 :大肠杆菌

IMPACT™ 试剂盒                             

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#E6901S
1 set
4,889.00

      


单独出售的相关产品

pTXB1 载体
#N6707S 10 μg . . . . . . .¥1,329
 
pTYB21 载体
#N6709S 10 μg . . . . . . .¥1,329
 
几丁质树脂
#S6651V 10 ml . . . . . . . . ¥529
#S6651S 20 ml . . . . . . .¥1,009
#S6651L 100 ml . . . . . . .¥4,029
 
抗 CBD 单克隆抗体
#E8034S 0.05 ml . . . . . . . . ¥669
 
pTWIN1 载体
#N6951S 10 μg . . . . . . .¥1,329
(不包含在试剂盒中)

特性

 单柱纯化且无需使用蛋白酶
 目的蛋白质不含来自载体的氨基酸
 可融合到目的蛋白的 N 端或 C 端
 重组蛋白的连接或标记
 可分离有或无 N 端甲硫氨酸的蛋白 

关于产品详细描述和 pTXB1 和 pTYB21 载体图谱,包括 MCS(多克隆酶切位点),请见目录 390-391 页。关于载体序列文件请登陆 www.neb-china.com,www.neb.com 查询。

概述

IMPACT(Intein Mediated Purificaiton with anAffinity Chitin-binding Tag)试剂盒利用经改良过的蛋白剪接元件(内含肽)进行一步亲和纯化重组蛋白(图 1)。该系统与其它蛋白融合表达系统的主要区别在于:无需蛋白酶作用,即可将重组蛋白与其亲和标签(Tag)分离。
 
IMPACT 试剂盒能够融合表达含有内含肽及来自芽孢杆菌(Bacillus circulans)的几丁质结合结构域(CBD)的蛋白,融合标签可以融合到目标蛋白的 C 端(pTXB1)或 N 端(pTYB21)(图 2)。在硫醇试剂(如DTT)的参与下,内含肽进行特异性的自我剪切,释放出目的蛋白。pTXB1 载体还可用于表达和纯化C 端含硫酯键的蛋白,并用于内含肽介导的蛋白连接(IPL)。IPL 反应,即表达蛋白连接,可通过一种天然肽键将 N 端为半胱氨酸的多肽或蛋白和一段细菌表达出的 C 端为硫酯键的蛋白连接起来,此反应可用于蛋白标记或半合成。有关 IMPACT 系统和 IPL 的更多信息请登陆 www.neb-china.com,www.neb.com 查询。
 
pTYB21 的内含肽标签包含酿酒酵母(Sce)VMA1 内含肽和几丁质结合域融合在目的蛋白的 N 末端。
 
pTXB1 是大肠杆菌表达载体,携带有一个小的蛋白自剪切元件即来自 Mycobacterium xenopi gyrA 基因的 mini 内含肽[Mxe GyrA 内含肽,22 kDa]。内含肽经修饰后与几丁质结合域(CBD)一起共同形成一个内含肽标签。该标签可与几丁质树脂(NEB #S6651)结合。使用硫醇试剂(如 DTT)或MESNA(2-mercaptoethanesulfonicacid)(后续连接用)诱导内含肽自我剪切并释放出目的蛋白。
 
pTWIN1 载体可分别使用蛋白 N-端的半胱氨酸和/或C-端的硫酯键对蛋白进行分离。载体上多克隆位点经设计优化,方便目的基因与 Ssp DnaB 或 Mxe GyrA内含肽融合表达。几丁质结合域(CBD)的存在便于蛋白纯化。该载体可单独购买。
 

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图 1:单柱亲和纯化麦芽糖结合蛋白(MBP)。泳道 1 :未诱导的细胞提取物。泳道 2 :诱导表达融合蛋白的细胞提取物。泳道 3:4℃ 过夜诱导裂解得到麦芽糖结合蛋白。泳道 4 :麦芽糖结合蛋白偶联到含有 N 端半胱氨酸的肽链上。Marker M 为蛋白分子量标准。
 

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图 2:IMPACT 系统流程图。


表 1:IMPACT 载体及其应用。
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 a 可使用 NEBuilder HiFi DNA 组装克隆试剂盒(NEB #E5520)进行无需限制性内切酶的构建。b 实际切割效率取决于临近的残基和融合蛋白的折叠。c DTT 仅用于蛋白纯化。MESNA 可以使分离的蛋白拥有一个 C-末端的巯酯键,可用于连接、标记和环化。d 半胱氨酸可用来替代 DTT。

IMPACT 试剂盒组成

– 大肠杆菌表达载体:pTXB1、pTYB21 和
pMXB10 对照载体
– 几丁质树脂:纯化融合蛋白的亲和基质
(结合容量 = 2 mg/ml) 
– 抗 CBD 单克隆抗体
– 二硫苏糖醇(DTT) 与 SDS 上样缓冲液

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