NEB代理,蛋白表达和纯化技术,NEBExpressTM MBP 融合表达及纯化系统
2022年11月8日产品资料 – 蛋白表达和纯化技术 – 表达系统 ：大肠杆菌
NEBExpressTM MBP 融合表达及纯化系统
#E8201S 1 set
产品特点
该产品可直接替换 NEB #E8200，pMAL™ 蛋白融合表达系统
NEBExpress® MBP 融合表达及纯化系统利用 Ptac 超强启动子和麦芽糖结合蛋白（MBP）的翻译起始信号来增强目标蛋白在大肠杆菌中的溶解度和表达水平。所得产物是 MBP 融合蛋白，后续可通过亲和反应进行纯化。
特性
·稳定可靠的大肠杆菌表达系统：蛋白产量高（可达 100 mg/L）
·目标蛋白与 MBP 融合表达可增强其在大肠杆菌中的溶解度（1）
·两步纯化：第一步：直链淀粉洗脱后使用 TEV 蛋白酶切割，第二步：经镍柱填料分离可获得高纯度的无标签的靶蛋白
·使用麦芽糖进行温和洗脱；无需洗涤剂或刺激性变性剂
概述
在 NEBExpress® MBP 融合表达及纯化系统中，pMAL-c6T 载体提供了一种将克隆基因或开放阅读框编码的蛋白质表达和纯化的方法。首先，将目标克隆基因插入大肠杆菌编码麦芽糖结合蛋白（MBP）的 malE 基因框架下游；这样构建的载体可表达 MBP 融合蛋白（2,3）。pMAL-c6T 载体表达 N 端标记六组氨酸的 malE 基因（缺少分泌信号序列，并且经改造可以与直链淀粉更紧密地结合），其后是 TEV 蛋白酶识别序列、多克隆酶切位点和三位终止密码子。pMAL-c6T 载体在细胞质中表达 MBP 融合蛋白。这种方法使用“tac”强启动子和 malE 翻译起始信号，从而能够使克隆序列进行高水平表达（4,5）。然后，利用 MBP 与麦芽糖的亲和特性，使用直链淀粉树脂对融合蛋白进行一步纯化（6）。
直链淀粉纯化后，可以使用 TEV 蛋白酶将 MBP 标签从目标蛋白上切下来，目标蛋白不残留任何载体衍生基团。MBP 标签和 TEV 蛋白酶均带有 His 标签，因此可轻松从反应中去除。将上述反应产物经 NEBExpress 镍柱填料（NEB＃S1428）分离，可去除 MBP 标签和 TEV 蛋白酶，从而在收集管液中可获得目标蛋白。目标蛋白产量最高可达 100 mg/L，一般产量为 10–40 mg/L。
图 1：NEBExpress® MBP 融合表达及纯化系统的原理图
图 2：使用 NEBExpress® MBP 融合表达及纯化系统进行蛋白表达
亲和纯化的 MBP6-TEV-ParamyosinΔSal 蛋白使用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。泳道 1：蛋白标准品。泳道 2：未处理的细胞。泳道 3：转入目标基因的细胞。泳道 4：使用麦芽糖从直链淀粉柱上洗脱下来的纯化融合蛋白。泳道 5：TEV 蛋白酶切割后的纯化蛋白。泳道 6：NEBExpress 镍柱填料收集管液分离的目标蛋白。
试剂盒组分
随产品提供如下试剂
| 名称 | 储存温度(℃) | 浓度 |
| pMAL-c6T DNA | 200 µg/ml | |
| Amylose Resin
|
4 | |
| TEV Protease
|
-20 | 10,000 units/ml |
| TEV Protease Reaction Buffer | -20 | 10 X |
| Anti-MBP Monoclonal Antibody | -20 | |
| MBP6 Protein | -20 | 40 µg/ml |
| MBP6-TEV-Paramyosin ΔSal | -20 | 5 mg/ml |
| E. coli ER2523 (NEB Express) (Glycerol Stock) | -20 |
储存温度
-20℃