TeloTAGGG™ 端粒长度检测试剂盒

端粒是位于真核细胞染色体末端的特殊DNA蛋白结构，由小串联重复DNA序列组成。已有许多端粒序列经过鉴定，显示其具有非常少的序列变异，甚至是在系统发育存在差异的生物体之间，如四膜虫（序列：TTGGGG)和人类（序列：TTAGGG)。
由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的末端，因此，有人认为每个复制周期都会导致染色体末端逐渐缩短（称为“末端复制问题”）。已在体外和体内经过证实的这种现象，似乎与正常体细胞的有限增殖能力（“有丝分裂钟”）有关。由于生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞都表现出具有延长甚至无限的寿命，因此有人提出这些细胞必须具有维持端粒长度的特定机制。
保持稳定的端粒长度与端粒酶的激活有关。该酶是一种核糖核蛋白，利用其内在RNA组分作为DNA合成的模板，通过在染色体末端添加重复序列来补偿端粒DNA的丢失。
端粒通过与结构蛋白发生特异性结合，对维持真核细胞内染色体的稳定性具有重要作用。这些蛋白质可以封闭线性染色体的末端，防止核降解、染色体末端融合、不规则重组以及其他通常对细胞致命的事件。
对人类外周血单核细胞研究样本中端粒长度的分析揭示了端粒长度随供体年龄的增加而降低，反映了这些细胞的复制史。已在多种疾病（如，唐氏综合征、共济失调性毛细血管扩张和HIV感染）中发现存在端粒丢失加速的现象，表明端粒长度缩短可能与这些疾病相关的免疫功能障碍有关。该试剂盒用于进一步了解关于这些关系的科学知识。

分析时间：约18小时
样品材料：细胞培养物和其他生物样品

用于测定端粒长度的非放射性化学发光检测法。

该试剂盒对末端限制性片段（TRF）进行Southern分析，这些片段是利用频繁切割限制性内切酶消化基因组DNA而获得的。
第1步：基因组DNA的消化
使用优化的频繁切割限制性内切酶混合物消化纯化的基因组DNA。选择的酶不会切割端粒DNA和亚端粒DNA。这是因为重复序列具有特殊序列特征。非端粒DNA被消化成低分子量片段。
第2步：凝胶电泳和Southern印迹
在DNA消化后，通过凝胶电泳分离DNA片段，然后通过Southern印迹将其转印至尼龙膜上。
第3步：杂交和化学发光检测
转印的DNA片段与端粒重复序列的特异性DIG标记探针杂交，然后使用与碱性磷酸酶共价连接的DIG特异性抗体孵育。最后，使用碱性磷酸酶的高灵敏度化学发光底物CDP-Star，使固定的端粒探针显色。通过对比信号与分子量标准品，可确定平均TRF长度。

TeloTAGGG^™ Telomere Length Assay被设计用于以下生命科学研究应用:

• 灵敏检测细胞培养物和其他生物研究样品中的端粒DNA（端粒序列：TTAGGG)[1]

• 检测细胞培养物和其他生物研究样品中DNA的端粒长度[2][3][4]

• 安全：非放射性

• 灵活：检测来自各种生物体（包括人类和小鼠）的端粒

1个试剂盒包含15种组分。

探针的序列和长度保密。试剂盒中的DIG标记MW是DIG MW III和VII的混合物

工作浓度：结合物的工作浓度取决于应用和底物

以下浓度应作为使用指南：

• 斑点杂交印迹：100 ng/ml

• ELISA：100 ng/ml

• 蛋白质免疫印迹：100 ng/ml

工作浓度：TAE缓冲液
0.04 M Tris-乙酸，0.001 M EDTA，pH 8.0
HCl溶液
0.25 M HCl
一个200 cm² 的印迹需要约250 ml溶液。
变性 溶液
0.5 M NaOH，1.5 M NaCl
一个200 cm² 印迹需要约500 ml溶液。
中和液
0.5 M Tris-HCl,3 M NaCl,pH 7.5
一个200 cm² 印迹需要约500 ml溶液。
20x SSC
3 M NaCl,0.3 M柠檬酸钠,pH 7.0
2x SSC
使用经高压灭菌的重蒸水稀释20x SSC(溶液5)，稀释比例为1:10。
DIG Easy Hyb杂交颗粒
使用64 ml经高压灭菌的重蒸水重悬颗粒（瓶8），并在37 °C孵育至全重悬。临用前几小时制备溶液。
严格洗涤缓冲液I
2x SSC，0.1% SDS
严格洗涤缓冲液II
0.2x SSC，0.1% SDS
洗涤缓冲液，1x
使用经高压灭菌的重蒸水稀释适量的洗涤缓冲液10倍浓缩液（瓶10），稀释比例为1:10。
封闭液，1x
使用1x马来酸缓冲液（溶液12）稀释适量的封闭液10倍浓缩液（瓶12），稀释比例为1:10。
马来酸缓冲液，1×
使用经高压灭菌的重蒸水稀释适量的马来酸缓冲液10倍浓缩液（瓶11），稀释比例为1:10。
DIG-AP抗体，工作溶液
为减少聚集抗体产生的背景，请在使用前将试剂瓶以13,000 rpm离心5分钟。
使用1x封闭液（溶液11）将适量DIG-AP抗体（瓶13）溶液稀释至终浓度为75 mU/ml (1:10,000)。
检测液，1x
使用经高压灭菌的重蒸水稀释适量的检测液10倍浓缩液（瓶14），稀释比例为1:10。
储存条件（工作溶液）：TAE缓冲液：
在15至25 °C下稳定保存
HCl溶液
在15至25 °C下稳定保存
变性 溶液
在15至25 °C下稳定保存
中和液
在15至25 °C下稳定保存
20x SSC
在15至25 °C下稳定保存
2x SSC
在15至25 °C下稳定保存
DIG Easy Hyb杂交颗粒
在15至25 °C下稳定保存3个月
严格洗涤缓冲液I
在15至25 °C下稳定保存
严格洗涤缓冲液II
在15至25 °C下稳定保存
洗涤缓冲液，1x
在15至25 °C下稳定保存
封闭液，1x
临用前配制。请勿储存
马来酸缓冲液，1×
在15至25°C下稳定保存。
DIG-AP抗体，工作溶液
临用前配制。请勿储存
检测液，1x
在15至25°C下稳定保存